钙在细胞培养中的应用

Dennis R. Conrad, 博士

钙在无血清真核细胞培养中的重要性和应用，包括杂交瘤细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养

钙是一种无血清培养基添加剂，适用于生物制造、组织工程学和特殊培养基

钙是一种离子稳定的二价阳离子，在细胞培养基中具有有益和有毒的双重属性，可作为一系列细胞培养基的组成部分。

经典培养基及其衍生物中的钙浓度各有不同，从开发用于培养软骨胚胎骨的Fitton-Jackson改良版BGJb培养基中的0，到用于培养鸡胚成纤维细胞（一种附着细胞系）的MCDB培养基201中的2 mM。一般来说，添加的血清中含有最高浓度的钙，例如为附着细胞而开发的经典培养基之一FBS。血清通常可保护细胞免受氧化损伤，在无血清培养基和用于原代和克隆细胞培养的培养基中钙的含量通常较低。这可能是由于原代细胞和以克隆密度生长的细胞对普遍存在于无血清培养基中因氧化过程，以及酶促反应和机械处理而破坏细胞膜钙毒性流入不敏感。由于钙可影响细胞信号转导、分化以及细胞附着，因此，针对特定细胞类型开发的培养基可能需要显著降低钙水平。

以下经典培养基含有1.8 mM钙：Basal Medium Eagle (BME)培养基；CMRL-1066培养基；杜氏改良Eagle培养基(DMEM)；Glascow最低必需培养基(GMEM)；H-Y培养基(Hybri-Max®)；199培养基；Eagle最低必需培养基(EMEM)；NCTC培养基；Swim S-77培养基； Williams Medium E. Click培养基；MCDB培养基、131培养基和Iscove改良杜氏培养基(IMDM)分别含有稍微更少的钙，分别为1.67、1.60和1.49mM。

L-15培养基和Ames培养基分别含有1.26和1.15 Mm的钙。

DMEM/Ham营养混合物F-12（50:50）经常用作培养用于生物制造的CHO细胞特殊培养基的基础培养基来源。该培养基含有1.05mM的钙，与MCDB培养基105中的钙水平非常接近，而110中的钙为1.0 mM。MCDB培养基可用于人类二倍体细胞的克隆生长。为培养原代细胞而开发的其他经典培养基，如Kaighn改良营养混合物Ham F-12培养基(F12K) (0.92 mM)、McCoy的5A改良培养基(0.9 mM)和Waymouth培养基MB (0.82 mM)，均含有接近1 mM的钙。

为CHO细胞开发的MCDB培养基302含有0.60mM的钙。营养混合物，如Ham F-10和F-12及无血清 /无蛋白杂交瘤培养基（基于F-12），都含有0.30mM的钙。RPMI-1640含有0.42mM的钙。培养基中用于CHO培养的钙浓度范围为0.30至1.05 mM。具有1.05mM钙的DMEM//F-12（50:50）培养基被更为广泛的作为基础用作开发用于生物制造的CHO培养基。

为角质形成细胞开发的MCDB培养基151和153含有非常低水平的钙，为0.03 mM。用于角质形成细胞的非常低水平的钙表明钙可能对特定细胞类型具有重要的调节或分化影响。

钙输送的管理是用于生物制造和组织工程的细胞培养基和体系开发的一项复杂但重要的要求。钙管理不当将会影响细胞贴壁、分化和存活状态。关于将钙作为细胞培养基添加剂的更多完整讨论，请查阅以下内容。

钙在细胞培养基中的主要功能：

钙与许多重要的细胞功能有关，包括酶活性、附着、迁移、组织形态，代谢过程、信号转导、复制以及特殊细胞如肌肉和神经细胞的电化学反应。它主要储存在内质网（ER）中。结合ER腔内钙的蛋白质包括蛋白质二硫键异构酶、钙网蛋白、内质网蛋白和网状钙粘蛋白。细胞含有许多非ER内腔钙结合蛋白，介导细胞活动和信号级联反应。这些蛋白质的实例包括钙结合蛋白、肌钙蛋白C、钙调蛋白和S-100蛋白。

钙细胞信号转导：钙可在多个水平参与受体介导的信号转导，促进蛋白激酶C与细胞膜的结合，并且在其通过肌醇1,4,5-三磷酸酯从内质网释放时可结合并激活钙调蛋白。环核苷酸cAMP和cGMP可作为第二信使。活化的钙调蛋白调节控制这些核苷酸的细胞内混合的环化酶和磷酸酶。活化的钙调蛋白还调节参与细胞周期进程的蛋白激酶和磷酸酶

细胞附着和组织形态：钙可促进细胞的附着，并介导影响细胞运动、形状和三维结构的许多细胞活动。它可调节钙粘蛋白、选择素和整联蛋白的功能。这些粘附分子家族分别调节同源细胞-细胞、异源细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用。钙也参与到ER内腔内的附着过程的信号转导。

钙循环：

健康的细胞在细胞外和细胞内的钙之间保持很大的浓度梯度。钙的正常细胞外浓度在1-3mM范围内，而细胞内浓度仅为0.1至0.2uM。多种膜运输通道调节钙稳态并调节细胞对环境刺激的反应。钙运输通道的损伤或细胞膜的完整性导致钙的快速流入。细胞膜损伤的主要原因是由氧化应激引发的脂质过氧化。细胞内钙的积累介导一系列破坏性事件，包括酶功能的破坏、离子和pH平衡以及关键细胞器如线粒体功能的改变。当膜损伤将细胞内钙浓度提高到0.5uM以上时，细胞的线粒体开始起作用以从细胞质中去除钙。

钙从细胞质到线粒体的转运是由内线粒体膜电位驱动的钙单向转运所介导的。这种膜电位是由线粒体基质和线粒体膜间空间之间存在的pH差异而引起的。随着钙通过单向转运进入基质，膜电位得以降低。线粒体通常使用几种转运蛋白从基质中去除钙。这些包括钠不敏感的低容量转运蛋白、钠/钙转运蛋白和高电导率相变孔。高容量相变孔能够可逆性的部分打开，也可以完全不可逆地打开。当细胞信号传导过程中线粒体基质钙水平急剧增加时，基质钙浓度的增加导致高容量孔隙向离子扩散开放。当孔呈开放状态时，钙便可从线粒体基质中逸出，同时质子便可进入基质。这导致线粒体内膜的暂时去极化。基质内pH值的升高导致高容量孔的闭合，电子传输链重新建立膜电位。ATP合成只有在膜电位重新建立时才会发生。钙通过线粒体的循环是钙动员刺激的正常和必要生理反应。它可起到很多不同的作用。当浓度超过约500nM时，可以通过快速去除它来缓冲细胞质中钙的影响。线粒体内钙激活TCA循环的多种酶并刺激增加的能量产生。

钙反常和细胞凋亡

通常细胞暴露于mM浓度的钙时不会产生毒性。当将细胞外钙从细胞中移除一段时间，然后将细胞再次暴露于钙时，则有时会发生广泛的细胞损伤和死亡。这种反常其实是由于细胞也被暴露在了会损伤细胞膜的条件下。这种现象通常在低氧后组织再氧化时观察到。细胞膜的氧化损伤可能是这种效应的一种常见介导因素。当细胞被胰蛋白酶消化时，经常使用钙螯合剂，如EDTA。当它们重悬于含钙培养基中时，胰蛋白酶和氧化作用对细胞膜的损伤可能使这些细胞对钙介导的细胞死亡敏感。培养基中钙的浓度通常在mM范围内，并且机械或化学损伤对细胞膜的损害可能导致钙泄漏到细胞中。一旦细胞内钙离子浓度超过500 nM，线粒体就会积极地将其吸收。由于细胞外钙的含量很大，线粒体不能重新建立钙的正常细胞内浓度。随着线粒体摄取钙，ATP合成停止，线粒体内膜去极化，基质pH上升，并且过量的钙与膜过渡孔结合导致其发生完全不可逆的开放。一旦这个孔完全打开，会发生一系列导致细胞凋亡诱导因子和细胞色素c释放的事件。最终的结果是凋亡性细胞死亡。

钙的化学特性使其成为一种有用的无血清培养基添加剂：

钙是一种丰富的二价土金属，在自然界中存在许多固体无机形式。它是叶子、骨头、牙齿和贝壳等植物和动物结构的重要组成部分，且尚未发现存在游离的状态。

钙在细胞培养中最大的化学问题是其溶解度和生物利用度。钙通常作为可溶性氯化钙添加到细胞培养基中。一旦进入溶液，钙就会重新分配并与介质中的其他离子和分子结合。细胞培养系统中有许多离子和分子可与钙结合并形成不溶性或微溶性分子。

磷酸钙

磷是细胞培养体系中普遍存在的元素，在某些条件下可形成钙沉淀。无机磷在生理pH下主要以一价和二价磷酸盐形式存在。磷酸钙在冷水中的近似溶解度为：一价磷酸盐Ca(H2PO4)2，71mM；磷酸氢钙，CaHPO4，1.7 mM和磷酸三钙，Ca3(PO4)2，0.06mM。在pH7.0时，大约61％的磷酸盐以二价形式存在，并且在pH7.6时，这会增加到大约87%。这种形式的磷酸钙溶解度约为1.7mM，并且通常用于培养基制剂中的最高浓度是1.8mM。这表明，只是在碱性滴定等手段使pH变为碱性时，才会出现磷酸根离子钙沉淀问题。由此产生的磷酸三钙将导致沉淀并在过滤时可能造成钙损失。