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案例分享,手把手教你液相色谱梯度优化
  各位小伙伴在实验分析中应该都遇到过这类问题,在液相色谱中,对于组分复杂的样品,采用一种色谱体系,往往很难得到理想的分离效果,要么分离时间太长,要么分离度太差。这种情况,采用梯度洗脱就可以缩短分析时间,提高分离效果。下面和大家分享一则梯度微调实例,一起感受下梯度微调对分离效果的奇妙影响吧。




  1、尽量在能长时间测试该项目的仪器上开发方法;

  2、需要了解系统的性能,避免出现仪器系统改变后不能重现的问题;

  3、要知道系统的两个基本情况:梯度滞后体积和比例精确性。这可以在同一个实验里得到这两个数据:参考《JJG7052014液相色谱仪检定规程》中《梯度误差》实验:在B溶液(0.1%丙酮)后加紫外检测器,设置一个多阶层的梯度,B溶液以5%的幅度从0%变到100%,流速与平常一样,流速为1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通运行梯度,记录图谱。每段梯度设置的时间与实际发生的梯度时间之差就是梯度延迟时间,阶层的高度可以用来测量流动相比例,这些阶层可能有点模糊,是由系统中混合体积造成的;

  4、检测完系统,就可以按照它的性能来设计方法。梯度方法转换最大的问题是梯度滞后体积,如果知道仪器的滞后体积比最初开发方法的仪器大,就要自觉的在方法前加一段等度来抵消这一差别,如果目标系统滞后体积小,就要在转移方法的时候在方法开始加一段梯度延迟时间,如果比例差别是在梯度运行中间出现的,也可以通过调节梯度图谱来抵消这种差别,但是一般很少遇到过需要这么做的情况。

  5、初始流动相没有充分平衡。柱子已经用初始流动相平衡了,但在分析中,梯度变化很快,而柱子没有用初始流动相充分平衡好,这样di一针时总是与后面的不一样。但是如果转移到有不一样滞后体积的系统时,可能就是另一种情况。

  项目背景

  名称:12种酚类

  色谱柱:月旭Ultimate®AQ-C184.6mm*150mm,5μm

  流动相A:水流动相B:乙腈

  问题:柱子正常活化进样,基线和整体出峰均不理想,分离度较差。

  1.柱子在运输或储存过程中保存液发生变化,导致填料产生微小改变,碳链蜷缩,未舒展开来,对目标物的保留造成影响;

  2.仪器系统存在梯度滞后,在梯度变化过程中,两相混合不精准,导致的物质分离问题;

  3.目标物受溶剂效应影响;

  4.梯度变化过快,流动相的洗脱能力太强,导致色谱峰未达到分离效果。

  1.测试梯度滞后体积和比例精确性;

  2.用初始流动相0.2流速过夜平衡柱子;

  3.样品用初始流动相溶解(慎用,改变样品溶剂后需要验证样品溶液的稳定性);

  4.调节梯度,减缓洗脱速率,减小洗脱能力;

  基线和峰形大有改善,但是最后一个峰在梯度时间外出峰了。

  梯度变化中,水相速率增长较快,物质保留变强,没有获得足够的洗脱能力,最后一个物质出峰较晚。

  前段分离好的梯度不做调整,调整最后一个物质出峰梯度阶段的有机相比例,增加洗脱能力。

  以上说明,项目的成功与否,不仅取决于色谱柱类型,仪器条件,还有方法的建立。其中流动相便是考察重点,流动相梯度洗脱必要时可以充分应用上,他是由几种不同极性的溶剂组成,通过改变流动相中不同时间段各溶剂组成的比例改变流动相极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子,并使样品的所有组分在最短时间内实现佳分离。好啦,今天的分享就先到这,希望能对小伙伴们有所启发有所帮助哦。


      以上就是杰星科技给您带来的关于案例分享,手把手教你液相色谱梯度优化的内容,如有更多问题可登陆我们的网站~




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